Oestrogeen masculiniseert neurale paden en sekse-specifiek gedrag

Samenvatting

Mannelijk gedrag vereist zowel testosteron als oestrogeen. Circulerend testosteron activeert de androgeenreceptor (AR) en wordt in de hersenen via aromatase omgezet in oestrogeen. Deze conversie is de primaire bron van oestrogeen voor het mannelijke brein. Het is onduidelijk of testosteron- en oestrogeensignalering interageren om neurale circuits te masculiniseren.

Met behulp van een genetische benadering tonen we uitgebreid seksueel dimorfisme aan in het aantal en de projecties van aromatase-expresserende neuronen. De masculinisering van deze cellen is onafhankelijk van de AR, maar kan worden geïnduceerd door zowel testosteron als oestrogeen; dit wijst op een rol voor aromatase bij de seksuele differentiatie van deze neuronen. We leveren bewijs dat suggereert dat aromatase ook belangrijk is bij het activeren van mannelijke agressie en urine-markering, aangezien deze gedragingen kunnen worden opgewekt door testosteron bij mannetjes die mutant zijn voor AR. Gecombineerd met aanvullende bevindingen suggereren onze resultaten dat de aromatisering van testosteron naar oestrogeen belangrijk is voor de ontwikkeling en activatie van neurale circuits die mannelijk territoriaal gedrag controleren.

Inleiding

Alle seksueel voortplantende soorten vertonen gender-dimorfismen in gedrag. Dergelijke seksverschillen zijn waarneembaar in diverse uitingen, waaronder paring, agressie, territoriale markering en ouderlijke zorg. Gedragsmatige dimorfismen zijn al zichtbaar bij sociaal naïeve dieren, wat suggereert dat de seksuele differentiatie van de onderliggende neurale circuits strak wordt gereguleerd door interne fysiologische regulatoren. Bij vertebraten spelen gonadale steroïdhormonen een centrale rol in de ontwikkeling en functie van deze neurale circuits.

Zowel testosteron als oestrogeen zijn vereist voor mannelijk gedrag bij veel vertebraten, waaronder zoogdieren. Het moet nog worden bepaald hoe deze twee hormonale paden elkaar kruisen om dimorfe gedragingen bij mannetjes te controleren.

Testosteron is essentieel voor mannelijk gedrag bij de meeste vertebraten, inclusief muizen en mensen. Testosteron medieert zijn effecten door AR te activeren; mannelijke muizen die mutant zijn voor deze receptor vertonen geen seksueel gedrag of agressie. Testosteron is essentieel in pasgeboren en volwassen mannelijke muizen voor het vertonen van sekse-specifiek gedrag zoals agressie. Men gaat ervan uit dat dit testiculaire hormoon neurale circuits masculiniseert bij neonatale knaagdieren en inwerkt op deze paden bij volwassen mannetjes om dimorf gedrag mogelijk te maken.

Ook oestrogeen is essentieel voor mannelijk gedrag. De behoefte aan oestrogeen om gedrag te masculiniseren lijkt tegenintuïtief, aangezien dit ovariale hormoon in de bloedsomloop van mannetjes vrijwel ondetecteerbaar is. Alle oestrogene steroïden worden in vivo gesynthetiseerd uit testosteron of verwante androgenen in een reactie die wordt gekatalyseerd door aromatase. Aromatase-expresserende cellen in de hersenen zetten circulerend testosteron om in oestrogen, en men denkt dat dit lokale oestrogeen dimorfe gedragingen bij mannetjes controleert.

Overeenkomstig de behoefte aan oestrogeen voor mannelijk gedrag, is aromatase-activiteit essentieel. Muizen die mutant zijn voor aromatase vertonen een sterke vermindering in mannelijk seksueel gedrag en agressie. Net als testosteron is oestrogeen essentieel bij neonaten en volwassenen voor het vertoon van dimorf gedrag bij mannetjes. Oestrogeen medieert veel van zijn effecten via signalering door de oestrogeenreceptoren ER$\alpha$ en ER$\beta$, die overlappende expressiepatronen vertonen en de masculinisering van de hersenen en het gedrag op een complexe, redundante manier reguleren. De rol van een derde oestrogeenreceptor, GPR30, in mannelijk gedrag is momenteel onbekend.

De dubbele behoefte aan testosteron- en oestrogensignalering bij mannelijk gedrag suggereert dat deze twee paden genetisch kunnen interageren om deze dimorfe uitingen te beheersen. Een potentiële plek van interactie is de controle over aromatase-expressie. We hebben daarom geprobeerd te bepalen of aromatase-expressie wordt gereguleerd door testosteron- of oestrogensignalering. Om aromatase-expressie op cellulaire resolutie te visualiseren, hebben we het aromatase-locus genetisch gemodificeerd zodat alle cellen die dit enzym tot expressie brengen ook twee reporters co-expresseren: nucleair gericht lacZ en placentaire alkalische fosfatase (PLAP), waardoor de cellichamen en projecties van aromatase-positieve neuronen worden gelabeld.

We stellen uitgebreid, voorheen onbeschreven seksueel dimorfisme vast in zowel het aantal als de projecties van neuronen die aromatase tot expressie brengen. De masculinisering van deze neurale paden is onafhankelijk van AR, maar kan bij neonatale vrouwtjes worden geïnduceerd door testosteron of oestrogeen, wat aangeeft dat aromatase een belangrijke rol speelt in de seksuele differentiatie van deze neuronen. Bovendien activeert testosteron typisch mannelijke gevechten en urine-markering onafhankelijk van AR, wat aantoont dat de differentiatie en functie van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan deze gedragingen, ten minste gedeeltelijk, worden bepaald door testosteron na de conversie naar oestrogeen. Tot slot tonen onze resultaten aan dat volwassen gonadale hormonen van beide seksen mannelijke territoriale markering en gevechten kunnen ondersteunen, mits oestrogen de onderliggende neurale circuits neonataal heeft gemasculiniseerd.

Resultaten

Aromatase wordt op spaarzame wijze tot expressie gebracht in de muizenhersenen

Om te definiëren waar testosteron kan worden omgezet in oestrogeen in de muizenhersenen, hebben we de expressie van aromatase op cellulaire resolutie gekarakteriseerd. We gebruikten homologe recombinatie in ES-cellen om een IRES-PLAP-IRES-nucleair LacZ reportercassette in de 3' UTR van het aromatase-locus te plaatsen. Deze strategie behoudt de expressie en functie van aromatase, waardoor het mogelijk is om neurale paden die dit enzym tot expressie brengen te onderzoeken in verder wildtype (WT) dieren. In scherp contrast met aromatase$-/-$ dieren zijn muizen die homozygoot zijn voor het aromatase-IPIN-allel vruchtbaar en gedragsmatig vergelijkbaar met hun WT-genoten, en hebben ze normale serumwaarden van testosteron en oestrogeen.

Analyse van $\beta\text{gal}$-activiteit in de hersenen onthult kleine groepen cellen die minder dan 0,5% van de neuronen in de hersenen uitmaken. We observeren $\beta\text{gal}$-gelabelde cellen op discrete locaties, waaronder:

• De posteromediale component van de bed nucleus van de stria terminalis (BNST).
• De posterodorsale component van de mediale amygdala (MeA).
• De preoptische hypothalamus (POA).
• Het laterale septum.

De expressie van $\beta\text{gal}$ weerspiegelt de distributie van aromatase-mRNA. Bovendien onthult het labelen van de hersenen voor PLAP-activiteit het soma en de projectieve vezels van neuronen die aromatase tot expressie brengen.

Aromatase-expresserende neuronen vertonen uitgebreid seksueel dimorfisme

Een vergelijking van aromatase-positieve cellen in volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen met het aromatase-IPIN-allel onthult verschillende voorheen onbeschreven seksuele dimorfismen. We vinden seksverschillen in zowel het aantal als de projectiepatronen van aromatase-expresserende neuronen:

• Aantal cellen: Mannetjes hebben meer aromatase-positieve cellen in de BNST en MeA vergeleken met vrouwtjes. In de caudale hypothalamus observeren we juist meer aromatase-expresserende cellen bij vrouwtjes dan bij mannetjes.
• Projecties (vezels): PLAP-labeling onthult een rijker plexus van vezels in de BNST en MeA bij mannetjes, en in de caudale hypothalamus bij vrouwtjes. We observeren ook dimorfe processen in de anterior hypothelamische regio en de ventromediale hypothalamus (VMH), waarbij PLAP-gelabelde vezels een groter volume innemen bij mannetjes dan bij vrouwtjes.

De patronen van PLAP-gelabelde vezels rond de VMH lijken op afferente input vanuit de BNST, MeA, POA en het septum. Elk van deze regio's tot expressie brengt aromatase, en draagt mogelijk bij aan de dimorfe PLAP-labeling in de VMH.

Seksuele differentiatie van aromatase-expresserende neuronen is onafhankelijk van AR

We hebben getest of masculinisering van aromatase-positieve neurale paden de activiteit vereist van androgenen zoals testosteron dat signaleert via AR. We kruisten muizen met het aromatase-IPIN-allel met dieren die het tfm-allel dragen, een loss-of-function allel van de X-gelinkte AR.

We stellen vast dat Tfm-mutante mannetjes een typisch mannelijke differentiatie van aromatase-positieve neuronen vertonen. Het aantal $\beta\text{gal}$-positieve neuronen in de BNST, MeA en caudale hypothalamus is vergelijkbaar tussen Tfm-mannetjes en WT-mannetjes. Ook de projectiepatronen in de VMH en het anterior hypothelamische gebied zijn typisch mannelijk bij Tfm-mutanten. Dit toont aan dat masculinisering van het aantal en de projecties van aromatase-expresserende neuronen grotendeels onafhankelijk is van testosteronsignalering via AR.

Oestrogeen masculiniseert aromatase-expresserende neuronen

We wilden bepalen of oestrogeen voldoende is om aromatase-expressie bij vrouwtjes te masculiniseren. Aangezien oestrogeen de seksuele differentiatie van neurale paden in de vroege neonatale periode bij mannelijke knaagdieren beïnvloedt, behandelden we vrouwelijke pups met het aromatase-IPIN-allel met oestrogeen op P1 (dag van geboorte), P8 en P15.

Bij vrouwtjes die neonataal oestrogeen kregen (NE), waren de aromatase-expresserende neurale paden ononderscheidbaar van die in WT-mannetjes. Dit bewijst dat neonataal toegediend oestrogeen zowel het celgetal als de projectiepatronen van aromatase-expresserende neuronen kan masculiniseren.

Omdat eierstokken bij neonaten inactief zijn, terwijl testikels direct na de geboorte een piek in circulerend testosteron produceren, hypotheseerden we dat de aromatisering van testosteron naar oestrogeen deze neuronen masculiniseert. Toediening van testosteron aan neonatale vrouwtjes bleek equivalent aan oestrogeensuppletie in het masculiniseren van deze paden, wat suggereert dat testosteron deze differentiatie induceert na conversie naar oestrogeen in vivo.

Oestrogeen bevordert celoverleving in de neonatale BNST en MeA

We onderzochten het mechanisme waarmee oestrogen de seksuele differentiatie aanstuurt. In de BNST en MeA is het aantal cellen dat aromatase tot expressie brengt bij P1 gelijk voor beide seksen, maar op P14 hebben mannetjes meer $\beta\text{gal}$-positieve cellen dan vrouwtjes.

Met behulp van de TUNEL-assay stelden we vast dat er in de BNST en MeA van vrouwtjes aanzienlijk meer apoptotische (stervende) cellen zijn dan bij mannetjes tussen P1 en P10. Met dubbele labeling zagen we dat veel van deze apoptotische cellen $\beta\text{gal}$ tot expressie brachten; er waren significant meer dubbel-gelabelde cellen in vrouwtjes dan in mannetjes.

Neonatale oestrogeentoediening verminderde de celdood zodanig dat het aantal TUNEL-positieve kernen in de BNST en MeA van NE-vrouwtjes ononderscheidbaar was van WT-mannetjes. Omgekeerd vertoonden mannetjes die mutant waren voor aromatase (KO) een niveau van celdood dat vergelijkbaar was met WT-vrouwtjes. Dit aantoont dat oestrogeen noodzakelijk en voldoende is om celoverleving in de BNST en MeA te bevorderen.

Neonatale blootstelling aan oestrogeen masculiniseert territoriaal, maar niet seksueel gedrag

We testten of sekse-specifiek gedrag ook was gemasculiniseerd bij volwassen NE-vrouwtjes:

• Seksueel gedrag: Zowel NE- als NV (controle) vrouwtjes vertoonden mannelijk seksueel gedrag (zoals mounten) met een lage frequentie richting andere vrouwtjes, vergelijkbaar met normale vrouwtjes en significant lager dan mannetjes. Neonataal oestrogeen verandert de lage frequentie van mannelijk seksueel gedrag bij vrouwtjes dus niet.
• Territoriaal gedrag: In tegenstelling tot NV-vrouwtjes, vielen de meeste NE-vrouwtjes een mannelijke indringer aan (resident-intruder agressietest), vergelijkbaar met mannetjes. Ook vertoonden ze het typisch mannelijke patroon van urine-markering (het verspreiden van vele kleine druppels over de kooi) in plaats van het vrouwelijke patroon (urine verzamelen in grote plassen bij de wanden).
• Seksuele receptiviteit: Neonatale oestrogene behandeling defeminiseerde de seksuele receptiviteit. NEAOP-vrouwtjes (neonataal oestrogeen + ovariectomie + priming) vertoonden een sterke afname in hun receptiviteitsindex en weigerden vaak mounts van mannetjes, waarbij ze het mannetje soms zelfs aanvielen.

We stelden vast dat de masculiniseerde hersenen van NE-dieren gebruikmaken van ovariale hormonen om deze mannelijke gedragingen te activeren; na ovariectomie stopten NE-vrouwtjes namelijk met vechten en urine-markeren.

Neonatale oestrogene blootstelling masculiniseert de reactie op testosteron onafhankelijk van AR

We hypotheseerden dat de verschillen in intensiteit van agressie tussen NE-vrouwtjes en WT-mannetjes te wijten waren aan lagere testosteronspiegels. We dienden testosteron toe aan volwassen, ovariectomiseerde vrouwtjes die neonataal oestrogeen hadden gekregen (NEAOT).

NEAOT-vrouwtjes vielen mannelijke indringers aan met een frequentie en duur die vergelijkbaar was met mannelijke bewoners. Ook hun urine-markering was ononderscheidbaar van die van mannetjes. Dit toont aan dat neonatale oestrogene blootstelling de reactie op testosteron bij volwassenen masculiniseert.

Om te bepalen of dit via AR gebeurt, onderzochten we AR-mutante (Tfm) mannetjes. Hoewel deze mutanten als volwassenen normaal gesproken niet agressief zijn en urine poolen, leidde toediening van testosteron (TfmAT) tot een significante toename in urine-markering en het vertonen van agressie tegen indringers, vergelijkbaar met WT-mannetjes. Dit levert bewijs dat testosteron veel componenten van mannelijk territoriaal gedrag bij volwassenen opwekt onafhankelijk van AR.

Discussie

De rol van aromatase-expresserende neuronen in het controleren van mannelijk gedrag

Onze reporters tonen aan dat een kleine groep aromatase-positieve neuronen waarschijnlijk invloed uitoefent op diverse neurale circuits die oestrogensignalering gebruiken om mannelijk gedrag te sturen. De reciproque connectiviteit tussen de geïdentificeerde regio's suggereert dat deze neuronen een onderling verbonden netwerk kunnen vormen dat seksueel dimorf gedrag reguleert.

Aromatase-expresserende neuronen zijn grotendeels beperkt tot neurale paden die betrokken zijn bij seksueel en agressief gedrag. De resultaten suggereren dat de aromatisering van testosteron naar oestrogeen een belangrijke rol speelt bij het activeren van mannelijk territoriaal gedrag.

Masculinisering door aromatase

Neonatale oestrogeenblootstelling masculiniseert aromatase-expresserende neuronen en territoriaal gedrag bij vrouwtjes. Dit is consistent met het feit dat mannetjes een neonatale piek in testosteron ervaren, wat leidt tot lokale oestrogensynthese in de hersenen via aromatase. De plasticiteit van het vrouwelijke brein voor deze effecten is tijdelijk; toediening van oestrogeen aan volwassen WT-vrouwtjes masculiniseerde de neuronen en het gedrag niet.

Onze resultaten tonen aan dat oestrogensynthese in zowel de neonatale als de volwassen fase voldoende is om aromatase-expresserende neuronen en territoriaal gedrag te masculiniseren, onafhankelijk van AR.

Cellulair mechanisme van oestrogeenwerking

Het seksverschil in celgetal in de BNST en MeA wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een verhoogde overleving van aromatase-positieve cellen bij mannetjes. Oestrogene signalering is noodzakelijk en voldoende om deze overleving te bevorderen. Dit suggereert dat oestrogeen werkt op de cellen die dit hormoon zelf synthetiseren, wat wijst op een positieve feedbackloop voor hun seksuele differentiatie.

Scheidbare componenten van gendergerelateerd gedrag

In tegenstelling tot fruitvliegen, waar dimorf gedrag unitair gereguleerd lijkt te worden, vinden we bij muizen dat dimorfe gedragingen kunnen worden gedissocieerd: neonatale oestrogeenblootstelling masculiniseert territoriaal gedrag, maar niet seksueel gedrag.

De neurale circuits die seksueel en territoriaal gedrag mediëren, worden dus gereguleerd door verschillende hormonale en temporele mechanismen. De resultaten suggereren dat het volwassen hormoonprofiel van de testikels niet noodzakelijk instructief is voor mannelijk territoriaal gedrag; hormonen geproduceerd door de gonaden van beide seksen ondersteunen mannelijke patronen van vechten en markering, mits neonataal oestrogeen de onderliggende circuits heeft gemasculiniseerd.

Experimentele procedures

Generatie van muizen met een gemodificeerd aromatase-allel

De IRES-PLAP-IRES-nLacZ reporter werd ingevoegd in de 3' UTR van het aromatase-locus. Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd volgens de IACUC-protocollen van UCSF.

Hormoonsuppletie

Vrouwelijke pups kregen subcutaan injecties van 5 $\mu\text{g}$ 17$\beta$-oestradiolbenzoaat (EB) of 100 $\mu\text{g}$ testosteronpropionaat in sesamolie op P1, P8 en P15. Controle-vrouwtjes kregen een voertuigsubstantie (NV). Voor NEAOT- en NVAOT-muizen werden volwassen NE- of NV-vrouwtjes ovariectomiseerd en vervolgens om de dag behandeld met 100 $\mu\text{g}$ testosteronpropionaat.

Histologie

Er werd gebruikgemaakt van seksueel naïeve, in groepen gehuisveste muizen. PLAP- of $\beta\text{gal}$-activiteit werd gevisualiseerd in hersensecties (80 $\mu\text{m}$ volwassen / 12 $\mu\text{m}$ neonataal). Celdichtheden en vezelinnervatie werden bepaald via onbevooroordeelde stereologie. Alle analyses werden uitgevoerd door een onderzoeker die blind was voor sekse, leeftijd, genotype en hormonale behandeling.

Gedragsanalyses

Muizen (10–24 weken oud) werden individueel gehuisvest. Tests vonden plaats $\geq 1$ uur na het uitdoen van het licht.

1. Seksueel gedrag: 30 minuten assay met een oestrische vrouwtjesmuis in de eigen kooi.
2. Territoriale markering: UV-visualisatie van urinepatronen op filterpapier na één uur exploratie van een nieuwe kooi.
3. Agressie: 15 minuten interactie met een WT intruder mannetje.

la a Voor vrouwelijke receptiviteit werden ovariectomiseerde muizen geprimed voor oestrus. Alle scores werden blind uitgevoerd via software ontwikkeld in Matlab.

Statistische analyse

De Chi-kwadraat test werd gebruikt voor proporties van gedrag. Andere vergelijkingen werden geanalyseerd met parametrische (Student's t-test) en non-parametrische (Kolmogorov-Smirnov) toetsen. Significantie werd vastgesteld bij $p < 0.05$.