De Oxford Nanopore MinION: het leveren van nanopore-sequencing aan de genomics-gemeenschap

Abstract

Nanopore DNA-strengsequencing is ontstaan als een concurrerende, draagbare technologie. Er zijn reads behaald die de 150 kilobasen overschrijden, en het is mogelijk gebleken om klinische pathogenen in het veld te detecteren en te analyseren. Wij vatten de belangrijkste technische kenmerken samen van de Oxford Nanopore MinION, het dominante platform dat momenteel beschikbaar is. Vervolgens bespreken we pioniersapplicaties die zijn uitgevoerd door de genomics-gemeenschap.

Introductie

Nanopore-sequencing werd gepionierd door David Deamer aan de University of California Santa Cruz, en door George Church en Daniel Branton (beiden aan Harvard University). Vanaf het begin van de jaren 90 bereikten academische laboratoria een reeks mijlpalen bij de ontwikkeling van een functioneel nanopore-sequencingplatform. Deze mijlpalen omvatten de translocatie van individuele nucleïnezure strengen in een enkele rij, procesmatige enzymatische controle van DNA met precisie op één enkel nucleotide, en het bereiken van resolutie op single-nucleotide niveau.

Verschillende bedrijven hebben nanopore-gebaseerde sequencingstrategieën voorgesteld. Deze omvatten ofwel: de excisie van monomeren uit de DNA-streng en het één voor één door een nanoporie leiden ervan (NanoTag sequencing (Genia), Bayley Sequencing (Oxford Nanopore)); of strengsequencing waarbij intact DNA base-voor-base door de nanoporie wordt getrokken (Oxford Nanopore MinION). Tot op heden is alleen strengsequencing op basis van de MinION succesvol toegepast door onafhankelijke genomics-laboratoria. Waar mogelijk richt dit overzicht zich op peer-reviewed onderzoek dat is uitgevoerd met de MinION.

DNA-strengsequencing met de Oxford Nanopore MinION

Oxford Nanopore Technologies (ONT) verkreeg in 2007 licenties voor kernpatenten voor nanopore-sequencing en begon in 2010 met inspanningen voor strengsequencing. Tijdens de Advances in Genome Biology and Technology (AGBT) conferentie van 2012 onthulde Clive Brown (Chief Technical Officer van ONT) de MinION nanopore DNA-sequencer, die vervolgens in april 2014 werd uitgebracht aan early-access gebruikers via het MinION Access Program (MAP).

De MinION is een draagbaar apparaat van 90 gram. De kern bestaat uit een flowcell met maximaal 2048 individueel adresseerbare nanoporiën die in groepen van 512 kunnen worden aangestuurd door een application-specific integrated circuit (ASIC). Voorafgaand aan de sequencing worden adapters geligeerd aan beide uiteinden van genomisch DNA of cDNA-fragmenten. Deze adapters vergemakkelijken de vangst van strengen en het laden van een procesmatig enzym aan het 5'-uiteinde van één streng. Het enzym is nodig om een unidirectionele verplaatsing op single-nucleotide niveau langs de streng te garanderen op een tijdschaal van milliseconden. De adapters concentreren bovendien DNA-substraten aan het membraanoppervlak nabij de nanoporie, waardoor de DNA-vangstfrequentie met enkele duizenden malen wordt verhoogd. Daarnaast maakt de hairpin-adapter het mogelijk om beide strengen van een duplexmolecuul opeenvolgend te sequencen door één streng covalent aan de andere te bevestigen. Bij vangst van een DNA-molecuul in de nanoporie beweegt het enzym zich langs één streng (de 'template read'). Nadat het enzym de hairpin is gepasseerd, herhaalt dit proces zich voor de complementaire streng (de 'complement read').

Terwijl het DNA door de porie gaat, detecteert de sensor veranderingen in de ionenstroom die worden veroorzaakt door verschillen in de verschuivende nucleotidevolgordes die de porie bezetten. Deze veranderingen in de ionenstroom worden gesegmenteerd als discrete gebeurtenissen met een bijbehorende duur, gemiddelde amplitude en variantie. Deze reeks gebeurtenissen wordt vervolgens computationeel geïnterpreteerd als een sequentie van 3 tot 6 nucleotide lange kmers ('woorden') met behulp van grafische modellen. De informatie van de template- en complement-reads wordt gecombineerd om een hoogwaardige '2D read' te produceren, gebruikmakend van een pairwise alignment van de event-sequenties.

Een alternatieve methode voor bibliotheekvoorbereiding maakt geen gebruik van de hairpin om de strengen van een duplexmolecuul te verbinden. In dat geval leest de nanoporie slechts één streng, wat resulteert in template-reads. Dit maakt een hogere doorvoer mogelijk vanuit een flowcell, maar de nauwkeurigheid van deze '1D reads' is iets lager dan die van een '2D read'.

Voordelen van MinION vergeleken met andere next generation sequencing-platforms

Detectie van basemodificaties

Next generation sequencing (NGS)-technologieën detecteren basemodificaties in natief DNA niet direct. Daarentegen kan single-molecule sequencing van natief DNA en RNA met nanopore-technologie modificaties op individuele nucleotiden detecteren. Eerder werd aangetoond dat een single-channel nanoporesysteem onderscheid kan maken tussen alle vijf de C-5 varianten van cytosine (cytosine (C), 5-methylcytosine (5-mC), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), 5-formylcytosine (5-fC) en 5-carboxylcytosine (5-caC)) in synthetisch DNA. De discriminatienauwkeurigheid varieerde van 92% tot 98% voor een cytosine van belang in een achtergrond van bekende sequenties.

In 2016 toonden twee onderzoeksgroepen onafhankelijk van elkaar aan dat MinIONs cytosine-methylering in genomisch DNA kunnen detecteren. Rand et al. ontwikkelden een probabilistische methode die een pair hidden Markov model (HMM) combineert met een hierarchical Dirichlet process (HDP) mengsel van normale distributies; zij behaalden een mediane nauwkeurigheid van 80% bij synthetisch DNA voor de classificatie tussen C, 5-mC en 5-hmC. Simpson et al. voerden een soortgelijke studie uit waarbij een HMM werd getraind voor een tweewegs-classificatie tussen C en 5-mC, met een nauwkeurigheid van 82% in menselijk genomisch DNA.

Real-time targeted sequencing

Het snel verkrijgen en analyseren van DNA- of RNA-sequenties binnen enkele uren is zeer voordelig, vooral voor klinische toepassingen. Dit is moeilijk met conventionele NGS-platforms, maar relatief eenvoudig met de MinION vanwege de omvang, kosten, eenvoudige bibliotheekvoorbereiding en draagbaarheid. Bovendien staat het MinION-platform real-time analyse toe omdat individuele DNA-strengen door de nanoporie worden getransloceerd, waardoor beslissingen kunnen worden genomen tijdens de sequencing-run.

Deze real-time bruikbaarheid van de MinION werd voor het eerst aangetoond door Loose et al. in een manuscript over targeted enrichment ('Read Until') van regio's van 5 en 10 kb uit fage lambda dubbelstrengs DNA (dsDNA). Kort samengevat wordt een mengsel van DNA-fragmenten op de MinION flowcell aangebracht. Terwijl een DNA-streng wordt gevangen en verwerkt in de nanoporie, worden de resulterende event-niveaus vergeleken met het verwachte patroon voor een doelsequentie. Als het patroon overeenkomt, gaat de sequencing door. Als het patroon niet overeenkomt, wordt de DNA-streng uit de nanoporie geworpen zodat een volgende DNA-streng kan worden gevangen en geanalyseerd. Hierdoor worden reads van de doelsequentie snel opgebouwd ten opzichte van de totale populatie DNA-strengen. 'Read Until' demonstreert hoe MinION-sequencing de tijd tussen biologische bemonstering en data-inferentie aanzienlijk kan verkorten, wat relevant is voor klinische toepassingen in het veld en bij point-of-care.

Verlenging van readlengtes met de MinION

Een voordeel van nanopore DNA-strengsequencing zijn de readlengtes die aanzienlijk groter zijn dan die van dominante NGS-platforms. Zo zijn 1D-reads van meer dan 300 kb en 2D-reads tot 60 kb behaald met Escherichia coli genomisch DNA. Om het nut aan te tonen, gebruikten Jain et al. MinION-reads van 36 kb+ om een vermeend gat van 50 kb in de menselijke Xq24-referentiesequentie op te lossen. Voorheen kon dit gat niet worden voltooid omdat het een reeks tandem-herhalingen van 4,8 kb van het kanker-testisgen CT47 bevatte. Dit werk stelde acht CT47-herhalingen in deze regio vast.

Detectie van structurele varianten

Fouten in assemblages van NGS-reads van 450 basen zijn problematisch bij het karakteriseren van structurele varianten in menselijke genomen. Dit probleem is acute aanwezig bij kanker, waar kopie-aantalvarianten, gen-duplicaties, deleties, inserties, inversies en translocaties veel voorkomen. Met reads die gemiddeld 8 kb lang waren, gebruikten Norris et al. de MinION om structurele varianten in een pancreaskankercellijn te detecteren. De auteurs concludeerden dat de MinION betrouwbare detectie van structurele varianten mogelijk maakte met slechts enkele honderden reads, vergeleken met de miljoenen reads die gewoonlijk nodig zijn bij NGS-platforms.

RNA-expressieanalyse

RNA-expressieanalyse wordt meestal uitgevoerd door NGS-sequencing van cDNA-kopieën. Een nadeel hiervan is dat de reads relatief kort zijn, waardoor cDNA-reads moeten worden geassembleerd tot volledige transcripten. Dit is problematisch voor het nauwkeurig karakteriseren van RNA-splice-isovormen omdat er vaak onvoldoende informatie is om de verschillende transcripten correct te ontrafelen. Volledige cDNA-reads zouden dit probleem vermijden en kunnen worden uitgevoerd met zowel PacBio als MinION platforms.

Ter illustratie gebruikten Bolisetty et al. de MinION om RNA-splicevarianten te bepalen en isovormen te detecteren voor vier genen in Drosophila. Een hiervan is Dscam1, het meest complexe alternatief gesplicte gen dat bekend is in de natuur, met 18.612 mogelijke isovormen variërend in lengte van 1806 bp tot 1860 bp. Zij detecteerden meer dan 7000 isovormen voor Dscam1 met >90% alignment-identiteit. Het identificeren van deze isovormen zou onmogelijk zijn geweest met NGS-reads van 450 basen.

Bioinformatica en platformverbeteringen

De eerste publicatie over de prestaties van de MinION was gebaseerd op beperkte data en ongeschikte analyse, wat leidde tot misleidende conclusies. In de daaropvolgende 9 maanden optimaliseerde ONT de sequencing-chemie en base-calling software. Samen met nieuwe MinION-specifieke bioinformatica-tools verbeterde dit de identiteit van de gesequenced reads (het aandeel basen in een read dat overeenkomt met een referentiesequentie) van een gerapporteerde 66% in juni 2014 naar 92% in maart 2015.

Tabel 1. Softwaretools specifiek ontwikkeld voor MinION-sequencedata

SNV: single nucleotide variant

De novo base-calling

Base-calling voor MinION-data wordt uitgevoerd met HMM-gebaseerde methoden via Metrichor, een cloud-dienst van ONT. Metrichor vereist momenteel een actieve internetverbinding en is closed source. Om een volledig open-source alternatief te creëren, ontwikkelden twee groepen in 2016 onafhankelijk base-callers voor MinION-data. Nanocall is een HMM-gebaseerde base-caller die efficiënte 1D base-calling lokaal uitvoert zonder internetverbinding, met nauwkeurigheden vergelijkbaar met Metrichor. DeepNano, een recurrent neural network framework, voert base-calling uit en levert betere nauwkeurigheden dan HMM-gebaseerde methoden. De mogelijkheid om lokale, offline base-calling uit te voeren is nuttig bij sequencing in het veld met beperkte internetconnectiviteit.

Sequentie-alignment

Aan het begin van het MAP werden conventionele alignmentprogramma's gebruikt voor MinION-reads. Omdat deze zijn ontworpen voor short-read technologieën (zoals Illumina), verschilden de resultaten sterk wanneer ze werden toegepast op 10-kb MinION-reads. MarginAlign werd ontwikkeld om alignments te verbeteren door foutbronnen in MinION-reads beter te schatten. Deze benadering op basis van expectation-maximization verbetert de mappingnauwkeurigheid aanzienlijk en leverde een maximum likelihood estimate van insertie-, deletie- en substitutiefouten op. Dit werd later gebruikt om een read-nauwkeurigheid van 92% te bereiken voor het E. coli k12 MG1655 genoom.

MarginAlign verfijnt alignments gegenereerd door programma's zoals LAST of BWA mem. GraphMap is een read-mapper die heuristieken gebruikt die zijn geoptimaliseerd voor langere reads en hogere foutmarges. Sović et al. toonden aan dat GraphMap een hoge sensitiviteit had (vergelijkbaar met BLAST) en dat de schattingen van de foutpercentages nauw aansloten bij die van marginAlign.

De novo assemblage

Het huidige foutprofiel van MinION-reads maakt ze grotendeels ongeschikt voor de novo assemblage-methoden die zijn ontworpen voor short reads (zoals de Bruijn graph-gebaseerde methoden). Dit komt omdat deze methoden vertrouwen op een nauwkeurige reconstructie van k-mers, terwijl de indel- en substitutiefouten van MinION te hoog zijn. Bovendien maken de Bruijn graphs geen gebruik van de langere reads van de MinION.

Nanopore-sequencing stimuleert daarom een terugkeer naar overlap-consensus assemblage-methoden. Omdat deze oorspronkelijk waren ontwikkeld voor Sanger-sequencing met lagere foutmarges, zijn nieuwe strategieën nodig om reads te corrigeren vóór assemblage. De eerste groep die dit demonstreerde behaalde een single contig assemblage van het E. coli K-12 MG1655 genoom met 99,5% nauwkeurigheid op baseniveau met uitsluitend MinION-data. Hun pipeline, 'nanocorrect', corrigeerde fouten door reads eerst te aligneren en vervolgens fouten weg te snoeien die duidelijk waren in de alignment graph. De gecorrigeerde reads werden geassembleerd met de Celera Assembler en verder verbeterd via het polishing-algoritme 'nanopolish'.

Single-nucleotide variant calling

Reference allele bias (de neiging om het referentie-allel over te rapporteren en non-referentie-allelen onder te rapporteren) wordt sterker wanneer de foutmarge van reads hoger is. Om dit op te lossen zijn specifieke tools ontwikkeld.

De module marginCaller in marginAlign gebruikt maximum-likelihood parameters om single nucleotide variants (SNV's) aan te duiden; bij een substitutiegraad van 1% detecteerde marginCaller SNV's met 97% precisie en recall bij een dekking van 60×. Sović et al. gebruikten GraphMap voor nauwkeurige mapping om heterozygote varianten in moeilijke regio's van het menselijk genoom te detecteren met meer dan 96% precisie.

Nanopolish gebruikt event-level alignments voor variant calling. Dit algoritme wijzigt iteratief de startreferentiesequentie om een consensus van de reads te creëren. Deze benadering werd gebruikt voor real-time surveillance in West-Afrika, waarbij Quick et al. ebola-virus sub-lineages identificeerden met een gemiddelde nauwkeurigheid van ~80%.

PoreSeq is een soortgelijk algoritme dat ook iteratief de likelihood maximaliseert op basis van event-level data. PoreSeq kan een hoge precisie en recall bij SNV-calling bereiken met lage sequencedata-dekking. In het M13 genoom behaalde PoreSeq een precisie en recall van 99% bij een dekking van slechts 16×.

Consensus-sequencing voor hoge nauwkeurigheid

Een read-nauwkeurigheid van 92% is nuttig, maar onvoldoende voor toepassingen zoals haplotype phasing en SNV-detectie in menselijke monsters bij lage dekking. Eén methode om de kwaliteit te verbeteren maakt gebruik van rolling circle amplification (RCA). Li et al. gebruikten RCA om meerdere kopieën van het 16S ribosomaal RNA (rRNA) gen in één aaneengesloten streng te genereren; sequencing hiervan gaf een consensus-nauwkeurigheid van meer dan 97%.

Huidige toepassingen van de MinION

Analyse van infectieuze agentia bij point-of-care

NGS kan virussen, bacteriën en parasieten in klinische monsters detecteren. De MinION biedt voordelen in readlengte, draagbaarheid en snelheid; pathogenen kunnen worden geïdentificeerd in slechts 6 uur na bemonstering, en in minder dan 4 minuten zodra het monster op de MinION is geladen. Toepassingen omvatten studies naar het chikungunya-virus, hepatitis C, Salmonella enterica en Salmonella typhimurium, alsofwel antibioticaresistentiegenen in Gram-negatieve isolaten en het mecA-gen in MRSA.

De meest inspirerende klinische toepassing was de analyse van ebolamonsters on-site in West-Afrika. Quick et al. transporteerden een MinION-sequencingkit (minder dan 50 kg) per commercieel vliegtuig naar West-Afrika en sequencen bloedmonsters van 142 ebola-patiënten in een veldlaboratorium. Data werden binnen 24 uur na levering gegenereerd, waarbij bevestiging van ebolasequenties soms slechts 15 minuten runtime kostte. Dit zijn de eerste toepassingen van sequencing voor real-time monitoring van een epidemie ter plaatse.

Onderwijs en citizen science

Door de lage instapkosten en draagbaarheid is de MinION ook nuttig voor onderwijs. Het is gebruikt in cursussen aan Columbia University en UC Santa Cruz, waarbij elke student eigen sequencing kon uitvoeren. Ook middelbare scholieren kregen via het Mount Desert Island Biological Laboratory in Maine de kans om experimenten uit te voeren als onderdeel van een 'Citizen Science' initiatief voor gezondheids- en milieufragen.

Aneuploïdie-detectie

Een directe toepassing is de detectie van aneuploïdie in prenatale monsters. Waar NGS-platforms hiervoor 1 tot 3 weken nodig hebben, gebruikten Wei en Williams de MinION om dit in minder dan 4 uur te doen. Zij concludeerden dat de MinION bruikbaar is voor aneuploïdie-detectie in een klinische setting.

MinIONs in de ruimte

Het detecteren van bacteriën en virussen tijdens bemande ruimtevluchten is momenteel lastig omdat monsters meestal naar aarde moeten worden gebracht. NASA plant om real-time sequencing en pathogeenidentificatie te testen op het International Space Station (ISS). In een proof-of-concept experiment demonstreerden Castro-Wallace et al. succesvolle sequencing en de novo assemblage van een lambda-fage genoom, een E. coli genoom en een muis mitochondriaal genoom. Er was geen significant verschil in datakwaliteit tussen het ISS en controlexperimenten op aarde.

Vooruitblik

PromethION

Voor gebruikers die behoefte hebben aan high-throughput sequencing heeft ONT de PromethION ontwikkeld. Dit bench-top instrument is modulair en bevat 48 flowcells die individueel of parallel kunnen draaien. Met 3000 kanalen per flowcell kan het tot 6 Tb aan data per dag produceren, wat gelijkstaat aan ongeveer 200 menselijke genomen per dag bij een 30× dekking.

Read-nauwkeurigheid

De huidige nauwkeurigheid van 92% is voldoende voor pathogeenidentificatie, maar medische toepassingen (zoals het detecteren van individuele nucleotide-substituties) vereisen meer dan 99,99%. Het is aannemelijk dat ONT de chemie en software zal blijven verbeteren; Q40 nanopore-sequencing zal waarschijnlijk een strategie van 'single strand re-read' inhouden.

Consensus-gebaseerde methoden verbeteren de nauwkeurigheid reeds aanzienlijk (bijv. tot 99,5% bij E. coli). De resterende 0,5% fout lijkt niet-random en komt mede door het onvermogen om homopolymeren langer dan zes nucleotiden op te lossen. Het oplossen van dit probleem zou de consensus-nauwkeurigheid naar $\ge$99,99% kunnen tillen.

Readlengte

Met de komst van single-molecule technologieën steeg de gemiddelde readlengte van 250 nucleotiden naar 10 kb. Recentelijk zijn met de MinION routinematig reads van meer dan 150 kb behaald. Dit zal helpen bij het begrijpen van complexe en repetitieve genomische regio's.

Directe RNA-sequencing

Directe RNA-sequencing is een actief ontwikkelingsgebied. Het detecteren van nucleotide-modificaties in zowel DNA als tRNA is reeds aangetoond. Directe RNA-sequencing zal inzichten bieden in de RNA-biologie die momenteel verloren gaan door reverse transcriptie en PCR-amplificatie.

Single-molecule eiwit-sensing

Hoewel massaspectrometrie de voorkeur heeft voor proteomics, zijn er beperkingen in sensitiviteit en resolutie. In 2013 demonstreerden Nivala et al. enzym-gemedieerde translocatie van eiwitten door een nanoporie, waarbij sequentie-specifieke kenmerken konden worden gedetecteerd. Eiwitsequencing zal studies naar complexe interacties tussen cellen in verschillende weefsels mogelijk maken.

Conclusies

Nanopore DNA-strengsequencing is inmiddels een gevestigde technologie. De prestaties zijn snel verbeterd, met readlengtes van 50 kb of meer en single-strand nauwkeurigheden boven de 92%. Dankzij de draagbaarheid heeft de MinION bewezen nuttig te zijn bij point-of-care in uitdagende veldomgevingen. Verdere miniaturisering (SmidgION) en geassocieerde tools voor bibliotheekvoorbereiding (Zumbador, VolTRAX) beloven een tijdperk van alomtegenwoordige sequencing. Parallelle toepassingen, waaronder directe RNA-sequencing, staan aan de horizon.

Afkortingen

• 5-hmC: 5-hydroxymethylcytosine
• 5-mC: 5-methylcytosine
• C: Cytosine
• dsDNA: Dubbelstrengs DNA
• HMM: Hidden Markov model
• ISS: International Space Station
• MAP: MinION Access Program
• NGS: Next generation sequencing
• ONT: Oxford Nanopore Technologies
• rRNA: Ribosomaal RNA
• SNV: Single nucleotide variant

Referenties

(De oorspronkelijke lijst met 72 bronverwijzingen is behouden in de documentatie)