Herstel van het regeneratieve potentieel van Müller-glia in het netvlies door het verstoren van de intercellulaire Prox1-overdracht
Abstract
Introductie
Cellen die dierlijke weefsels vormen, worden geproduceerd tijdens de ontwikkeling en degenereren vervolgens gedurende het leven van een organisme. In veel dierlijke weefsels die stamcellen bevatten, zoals de huid, lever en darmen, worden gedegenereerde cellen aangevuld door nieuwe cellen, waardoor deze weefsels hun functies kunnen behouden ondanks continu celverlies. Echter, neuronen in de meeste weefsels binnen het centrale zenuwstelsel (CZS) van zoogdieren missen het vermogen tot regeneratie, terwijl CZS-weefsels in koudbloedige gewervelden, zoals vissen en amfibieën, hun regeneratieve potentieel behouden. Eerdere studies suggereren dat dit verschil voortkomt uit de afwezigheid van bevorderende factoren en/of de aanwezigheid van onderdrukkende factoren die een reeks regeneratieve gebeurtenissen reguleren, waaronder de herprogrammering, proliferatie en neuronale differentiatie van neurale stam- en progenitorcellen (NSCs/NPCs). De identiteit van deze regulerende factoren is echter grotendeels onbekend.
Het netvlies is een waardevol model voor het bestuderen van de ontwikkeling van neuraal weefsel en regeneratiemechanismen. Netvliesregeneratie is primair afhankelijk van Müller-glia (MG), die kunnen worden herprogrammeerd tot neurale progenitorcellen (MG-afgeleide retinale progenitorcellen, of MGPCs), die opnieuw de celcyclus ingaan om netvliesneuronen te regenereren. MG staan erom bekend proliferatiepotentieel te hebben in volwassen visnetvliezen en worden beschouwd als een bron van netvliesneuronen na degeneratie door letsel. MGPCs treden opnieuw in de celcyclus om zichzelf uit te breiden en differentiëren in verschillende typen netvliescellen, waaronder staaf-fotoreceptoren (rPRs) en retinale ganglioncellen (RGCs), die respectievelijk worden aangetast bij netvliesziekten zoals retinitis pigmentosa (RP) en glaucoom. Deze differentiatie wordt strak gereguleerd door transcriptiefactoren en extracellulaire signalen, die helpen om geregenereerde neuronen te integreren in het bestaande netvliescircuit.
Het regeneratieproces bij vissen en amfibieën wordt geïnitieerd door signalen uit het beschadigde netvlies, waarbij meerdere paden de herprogrammering en proliferatie van MG reguleren. Zo wordt Wnt-signalering geactiveerd als reactie op netvliesbeschadiging; inhibitie hiervan voorkomt regeneratie, hoewel het op zichzelf onvoldoende is om netvliesneuronen te regenereren, maar wel MG kan herprogrammeren naar RPC. Notch-signalering wordt ook geactiveerd tijdens de regeneratie van het zebravissennetvlies, maar moet worden onderdrukt voor de proliferatie van MGPCs en hun daaropvolgende neuronale differentiatie. Daarentegen kan sonic hedgehog (Shh)-signalering, die hairy and enhancer of split-1 (Hes1) deelt met Notch-signalering als downstream-effector in RPCs, de proliferatie van MGPCs bevorderen en de differentiatie van MGPCs naar netvliesneuronen sturen. Andere mitogenen, zoals fibroblastgroeifactor (Fgf) en heparin-binding epidermal growth factor (Hbegf), worden ook opgereguleerd na netvliesbeschadiging en bevorderen MGPC-proliferatie en neurale differentiatie in zowel vissen als amfibieën. Naast deze externe signalen kunnen veranderingen in intracellulaire paden die yes-associated protein (Yap) en WW domain-containing transcription regulator 1 (TAZ) onderdrukken, dit proces ondersteunen.
Echter, in tegenstelling tot koudbloedige gewervelden, herprogrammeren zoogdier MG-cellen zich na letsel niet natuurlijk tot RPCs die in staat zijn netvliesneuronen te regenereren. In plaats daarvan dedifferentieeren ze gedeeltelijk voordat ze terugkeren naar een rusttoestand. Dit beperkte regeneratieve potentieel is toegeschreven aan het gebrek aan activerende factoren en de aanwezigheid van inhiberende factoren. Zo omvat de regeneratieve incompetentie van zoogdier MG een defecte expressie van belangrijke neurogene factoren, zoals achaete-scute family bHLH transcription factor 1 (Ascl1) en lin-28, zoals blijkt uit het vermogen van ectopisch tot expressie gebrachte Ascl1 om de herprogrammering van MG naar RPCs in het beschadigde muizennetvlies te triggeren. Echter, Ascl1 alleen is niet voldoende; epigenetische veranderingen, waaronder histonacetylering en DNA-demethylering, zijn ook noodzakelijk voor de herprogrammering van MG naar RPCs.
De Prospero-related homeobox 1 (Prox1), een evolutionair geconserveerde transcriptiefactor, is aangetoond in staat te zijn de proliferatie van NSCs/NPCs te blokkeren, maar de differentiatie van deze cellen naar neuronen te induceren. In Drosophila onderdrukt de Prox1-homoloog prospero (pros) de expressie van achaete-scute complex (asc)-genen—homoloog aan het zoogdier Ascl1—en verlaagt het de cycline E (CycE)-niveaus terwijl het dacapo (DAP), een cycline-afhankelijke kinase-inhibitor, induceert om te voorkomen dat post-mitotische neuroblasten opnieuw de celcyclus ingaan. Deze anti-NPC-functies zijn ook geconserveerd in zoogdier Prox1, waar het een kritieke rol speelt in neurogenese door de celcyclusuitgang van NPCs in ontwikkelende neurale weefsels te faciliteren.
In het ontwikkelende muizennetvlies stimuleert Prox1 de differentiatie van RPCs naar horizontale cellen (HCs). In het volwassen muizennetvlies wordt Prox1 breed tot expressie gebracht in de interneuronen, waaronder de HCs, bipolaire cellen (BCs), en een subset van A2-amacrine cellen (AC). In deze studie ontdekten we dat, naast de expressie in deze netvliesneuronen, Prox1 ook aanwezig is in de MG van het beschadigde muizennetvlies, maar niet in dat van de zebravis. Opvallend is dat Prox1 niet endogeen tot expressie komt in muis MG; in plaats daarvan wordt het verworven van netvliesneuronen via intercellulaire eiwitoverdracht—een bekend kenmerk van homeodomeine-eiwitten (HPs). Bijgevolg konden we de herprogrammering van MG naar RPCs induceren in het beschadigde muizennetvlies door de overdracht van Prox1 van donor-netvliesneuronen naar MG te verstoren. Omgekeerd onderdrukten we de MGPC-proliferatie in zebravissen door recombinant Prox1-eiwit intraoculair te injecteren. Deze resultaten suggereren dat exogeen Prox1 een belangrijke onderdrukker is van MG-herprogrammering; daarom zou de eliminatie ervan zoogdier MG competent maken voor letsel-geïnduceerde netvliesregeneratie.
Resultaten
Accumulatie van Prox1-eiwit in muis MG na netvliesletsel
Naast de stabiele en robuuste expressie in muizennetvliesneuronen, was Prox1 detecteerbaar in MG op relatief lagere niveaus dan in de netvliesneuronen. Interessant genoeg waren Prox1-immunokleuring-signalen in MG significant verhoogd na degeneratie van fotoreceptoren (PR) geïnduceerd door N-methyl-N-nitrosourea (MNU), terwijl de Prox1-intensiteit in andere netvliessubsets onveranderd bleef. Vergelijkbare bevindingen werden waargenomen in muizennetvliezen die waren blootgesteld aan intensieve lichtexpositie (die PRs beschadigt) en intravitreale injectie van N-methyl-D-aspartaat (NMDA) (dat BCs, ACs en RGCs doet degenereren). De Prox1-opregulatie werd ook opgemerkt in Crx-CreERT2;R26DTA/+ muizennetvliezen, waar selectieve PR-degeneratie wordt geïnduceerd door difterietoxine A (DTA). De accumulatie van Prox1 in MG was uitgesprokener in MNU-behandelde en Crx-CreERT2;R26DTA/+ muizennetvliezen vergeleken met licht-beschadigde netvliezen, waar PR-degeneratie en MG-delaminatie minder ernstig waren. Deze bevindingen suggereren dat verhoogde Prox1-expressie in MG een algemene reactie is op netvliesletsel in muismodellen, onafhankelijk van het type celdegeneratie, maar geassocieerd met de ernst van het letsel. In tegenstelling tot het muizennetvlies veroorzaakten MNU- en NMDA-geïnduceerde letsels geen significante toename van Prox1-niveaus in MG van zebravissen, die bekend staan om hun herprogrammering naar MGPCs als reactie op netvliesletsel voor daaropvolgende proliferatie en differentiatie naar netvliesneuronen.
Exogene oorsprong van Prox1-eiwit in muis MG
De letsel-geïnduceerde accumulatie van Prox1 in MG was een onverwachte ontdekking, aangezien de niveaus van Prox1-mRNA in MG-lijncellen consistent laag bleven zonder significante veranderingen na NMDA- of licht-geïnduceerd letsel aan muizen- en zebravissennetvliezen. Om dit fenomeen verder te onderzoeken, gebruikten we RNAscope in situ RNA-hybridisatie. We observeerden echter geen toename van Prox1-mRNA binnen de MG na MNU-letsel. Dit resultaat werd verder gevalideerd via kwantitatieve reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyse van Prox1-mRNA in tdTomato (tdTom)-positieve MG, die waren geïsoleerd uit Glast-CreERT;R26tdTom/+ muizennetvliezen via fluorescence-activated cell sorting (FACS).
Vervolgens onderzochten we de transcriptie op de muis Prox1-genlocus in MG door gebruik te maken van Prox1fg-muizen, die in staat zijn om EGFP complementair tot expressie te brengen op de Prox1-genlocus na Cre-gemedieerde deletie van het floxed Prox1-knock-in-allel. Zoals verwacht werd robuuste EGFP-expressie waargenomen in HCs, BCs, en AC-subsets in Prox1fg;Dkk3-Cre muizen. De complementaire EGFP-expressie werd echter nauwelijks waargenomen in MG van de Prox1fg;Dkk3-Cre muizennetvliezen, terwijl EGFP-expressie wel werd gevonden in hun netvliesneuronen.
In de Tam-behandelde Prox1fg/fg;Glast-CreERT;R26+/tdTom muizennetvliezen vertoonden de tdTom-positieve, Cre-beïnvloede, Prox1-gedeleteerde MG geen EGFP-signalen. Bovendien vertoonden EGFP-signalen geen toename in tdTom-positieve MG na MNU- of NMDA-geïnduceerde netvliesletsels. Echter, Prox1-immunokleuring-signalen waren nog steeds verhoogd in deze MG-cellen in de beschadigde Prox1fg/fg;Glast-CreERT;R26+/tdTom muizennetvliezen. Gezamenlijk suggereren onze data dat MG in beschadigde muizennetvliezen Prox1 accumuleren zonder toename van de expressie van het endogene Prox1-gen.
Exogeen Prox1 onderdrukt letsel-geïnduceerde proliferatie van MG
Voorheen rapporteerden we dat Prox1-eiwit het potentieel heeft om tussen cellen te worden overgedragen, een kenmerk dat wordt gedeeld door de meerderheid van de homeodomeine-eiwitten. Daarom is het aannemelijk dat muis MG Prox1 opneemt die wordt uitgescheiden door naburige netvliesneuronen met actieve Prox1-genexpressie (d.w.z. HCs, BCs, en ACs). Onze data tonen aan dat BCs de grootste populatie netvliescellen vertegenwoordigen die het Prox1-gen tot expressie brengen. Daarom onderzochten we of BCs als bron van Prox1 voor MG kunnen dienen door het Prox1-gen genetisch te elimineren en EGFP complementair tot expressie te brengen in BCs van Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizen. Deze manipulatie leidde tot een significante vermindering van Prox1-intensiteit in EGFP-negatieve MG alsovel als EGFP-positieve BCs in Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizennetvliezen vergeleken met Prox1fg/fg littermate muizennetvliezen, zonder veranderingen in Prox1-intensiteit in HCs en ACs. De visuele acuity van de Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizen verschilde overigens niet significant van die van de Prox1fg/fg littermates.
Opmerkelijk genoeg nam het aantal EdU-gelabelde MG significant toe in de beschadigde netvliezen van Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizen. Deze bevindingen suggereren dat MG proliferatiepotentieel verkrijgen bij een afname van exogeen Prox1 dat wordt overgedragen vanuit netvliesneuronen. Om deze hypothese te testen, voegden we Prox1 toe aan het netvlies door intravitreale injectie van FLAG-tagged recombinant Prox1-eiwit in Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizenoogen. In MNU-beschadigde netvliezen waren FLAG-Prox1-eiwitten detecteerbaar in MG, waarbij hun aanwezigheid gedurende enkele dagen aanhield. De toediening van FLAG-Prox1 resulteerde in een afname van het aantal EdU-gelabelde MG, maar een toename in het aantal EdU-gelabelde microglia in de beschadigde netvliezen van Prox1fg/fg;Chx10-CreERT2 muizen.
Om de inverse relatie tussen de accumulatie van exogeen Prox1-eiwit en MG-celproliferatie verder te onderzoeken, injecteerden we ook FLAG-Prox1 in zebravissenoogen. De FLAG-Prox1 was detecteerbaar in EGFP-positieve MG van MNU-beschadigde gfap:EGFP zebravissennetvliezen. Deze manipulatie leidde tot een afname van het aantal Ascl1a-positieve MGPCs in deze visnetvliezen. Het verminderde ook de EdU-positiviteit van Sox2;EGFP-positieve MG of MGPCs. Bijgevolg werd de regeneratie van netvliesneuronen verminderd in de beschadigde zebravissennetvliezen die waren geïnjecteerd met FLAG-Prox1.
Herstel van MG-proliferatie in beschadigd muizennetvlies door het wegvangen van extracellulair Prox1
Alternatief probeerden we de Prox1-overdracht naar MG te verstoren door het in de extracellulaire ruimte weg te vangen met behulp van een anti-Prox1-antilichaam. Het konijnen polyklonaal anti-Prox1-antilichaam dat werd geïnjecteerd in de intravitreale ruimte van MNU-beschadigde Glast-CreERT;R26tdTom/+ muizenoogen kon het Prox1-niveau in MG verlagen, wat suggereert dat de intercellulaire overdracht van Prox1 door het antilichaam wordt geblokkeerd. Verder bereidden we, voor stabiele toediening van het antilichaam aan het netvlies, een cDNA voor een single-chain fragment (scFv) van kippen-immunoglobuline met een affiniteit voor Prox1. Het anti-Prox1 scFv-antilichaam ($\alpha$Prox1) blokkeert effectief de overdracht van Prox1 tussen gecultiveerde cellen. De $\alpha$Prox1 werd gefuseerd met de signaalsequentie van menselijk interleukine-2 (IL-2) voordat het werd geïntroduceerd in het genoom van een adeno-geassocieerd virus (AAV), dat bekend staat om zijn effectieve gentoediening aan het muizennetvlies. De resulterende AAV2/2-serotype virussen (AAV2-$\alpha$Prox1) werden geïnjecteerd in de glasvochtruimte van muizenoogen, gericht op netvliescellen in de GCL en INL om $\alpha$Prox1 in de extracellulaire ruimte van het netvlies uit te scheiden. In de muizennetvliezen geïnfecteerd met AAV2-$\alpha$Prox1 werd de letsel-geïnduceerde accumulatie van Prox1 in de MG geremd, zonder de Prox1-niveaus in netvliesneuronen te veranderen. In tegenstelling hiermee had infectie met AAV2-Control-antilichaam (AAV2-Ctrl Ab), dat een scFv tot expressie brengt zonder affiniteit voor Prox1, geen effect. Bovendien merkten we op dat het aantal MG dat EdU incorporeerde 4 dagen na MNU-letsel verhoogd was in muizennetvliezen geïnfecteerd met AAV2-$\alpha$Prox1 vergeleken met die geïnfecteerd met AAV2-Ctrl Ab. Gezamenlijk suggereren onze bevindingen dat Prox1, afkomstig van netvliesneuronen (waaronder BCs), een onderdrukkende rol speelt in de letsel-geïnduceerde proliferatie van MG en/of de overgang naar RPCs via intercellulaire overdracht.
Groetjes,