Hoe Claude eiwitbinders ontwierp tegen schorpioen-neurotoxinen

In augustus lieten we zien hoe Claude eiwitminibinders ontwierp na één enkele prompt. Een maand voordat we die resultaten publiceerden, benaderde een team van Citrini Research ons met een interessante vraag: zou Claude (en AI-drugdiscovery in het algemeen) een groep gemotiveerde niet-experts in staat kunnen stellen om een echt probleem in de menselijke gezondheidszorg aan te pakken? Leden van ons life science-onderzoeksteam wilden dit beantwoorden, beginnend met een brainstormsessie met Claude. Uiteindelijk besloten we Claude hulp te vragen bij het ontwerpen van nieuwe eiwitbinders tegen schorpioen-neurotoxinen, in de hoop dat deze ooit kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een schorpioen-tegendiggif.

Jaarlijks worden er 1,2 miljoen of meer mensen gestoken door schorpioenen, wat resulteert in meer dan 3.250 doden, voornamelijk onder kinderen in delen van de wereld met beperkte toegang tot medische zorg. Nieuwe behandelingen zijn duur om te produceren en het is onwaarschijnlijk dat de ontwikkelingskosten worden terugverdiend. Vanwege deze geringe investeringen wordt schorpioenvergiftiging omschreven als een verwaarloosde tropische ziekte.

We begonnen door Claude dezelfde prompt te geven die we hadden gebruikt in ons eerdere onderzoek naar eiwitbinders, na aanpassingen door Citrini. Gedurende de volgende 64 uur werkte een intern onderzoeksmodel binnen Claude Science grotendeels autonoom, hoewel we het werk stuurden met vier vervolgvragen. Onder ons toezicht analyseerde Claude de onderzoeksgegevens, genereerde de figuren en stelde het definitieve rapport op.

De ontwerpcampagne van Claude leverde 17 eiwitbinders op die elk binden aan een van de vier schorpioen-neurotoxinen die bekendstaan als gevaarlijk voor mensen. Tijdens het proces genereerde Claude 318.484 eiwitontwerpen en selecteerde er 180 voor testen. Ons team voegde er met hulp van Claude nog 31 toe. Onze partners bij Adaptyv Bio en Twist Bioscience, twee contract research organizations (CRO's), testten alle 211 ontwerpen in het laboratorium om te zien of ze bonden aan de toxinen waarvoor ze waren ontworpen. 17 ontwerpen voldeden aan onze criteria voor een binder. We hebben niet bevestigd of deze binders schorpioengif neutraliseren in een cellulaire omgeving, dus we claimen niet dat we een tegendiggif hebben geproduceerd.

We hebben het werk van Claude voorgelegd aan twee externe experts, Susana Vázquez Torres en Timothy P. Jenkins, die aangaven dat dit werk een veelbelovende eerste stap is. Als AI nu in enkele dagen geloofwaardige binders kan ontwerpen tegen verschillende moeilijk te targeten toxinen, en deze binnen enkele weken in het lab bevestigd kunnen worden, zou dit in theorie de ontdekking van behandelingen voor vergiftigingen en andere verwaarloosde ziekten kunnen versnellen. De uitdaging blijft om deze binders om te zetten in veilige, betaalbare en breed toegankelijke medicijnen.

We delen meer details in ons technische rapport en stellen alle 211 ontwerpen en hun data beschikbaar.

Het ontwerpen van een binder tegen vrijwel elk doelwit lijkt niet langer onrealistisch. We kunnen nu zeer sterke binders opmerkelijk snel verkrijgen, waardoor de binding zelf niet langer de belangrijkste bottleneck is. Voor giftige dieren zoals slangen en schorpioenen, wiens beten en steken grote aantallen mensen doden of ernstig verwonden — vooral in onderbediende regio's — zal de werkelijke impact komen van het aanpakken van de delen van de therapeutische pijplijn die verder gaan dan binding. De uitdaging is om deze buitengewone instrumenten te gebruiken om moleculen te ontwikkelen die echte medicijnen kunnen worden: veilig, betaalbaar en breed toegankelijk.

Susana Vázquez Torres, Postdoctoraal Onderzoeker, Structural Biology Programme, Spaans Nationaal Kankeronderzoekscentrum (CNIO), Madrid, Spanje.

De novo-ontwerp van binders tegen vijf toxinen van vier schorpioensoorten

Schorpioengif bevat meerdere eiwit-neurotoxinen. De neurotoxinen die mensen het meeste kunnen schaden of doden, hechten zich aan natriumkanalen: grote eiwitten in de membranen van zenuwcellen die hen in staat stellen signalen af te vuren. Wanneer natriumkanalen worden verstoord, vuren zenuwen op het verkeerde moment, wat grote hoeveelheden stresschemicaliën zoals adrenaline vrijgeeft. In ernstige gevallen kan dit leiden tot hartfalen en overmatige vochtophoping in de longen, wat soms fataal is.

Er zijn enkele tegendiggiften beschikbaar voor schorpioensteken. Deze worden over het algemeen gemaakt met behulp van antilichamen van geïmmuniseerde dieren, een proces dat maanden kan duren. Gif wordt gemolken van duizenden schorpioenen en gebruikt om paarden te immuniseren; wetenschappers zuiveren vervolgens de resulterende antilichamen uit het bloed van de paarden. Traditionele tegendiggiften kunnen werken als ze vroegtijdig worden toegediend, maar ze zijn meestal effectief voor slechts een klein aantal neurotoxinen. Daarnaast zijn ze duur om te produceren en in veel regio's kostbaar of schaars.

De novo-ontwerp biedt een potentiële oplossing. Een binder is een molecuul dat zich stevig hecht aan een specifiek doelwit; antilichamen zijn een natuurlijk voorbeeld hiervan. In principe zou een binder die zich richt op het deel van een neurotoxine dat zich aan de natriumkanalen hecht, het toxine kunnen blokkeren. Bij de novo-ontwerp worden eiwitbinders vanaf nul gegenereerd tegen een specifiek doelwit. Deze binders worden computationeel ontworpen en kunnen worden geoptimaliseerd voor medicijnachtige eigenschappen zoals potentie en stabiliteit, wat de levering in regio's waar steken het vaakst voorkomen, zou kunnen vergemakkelijken.

Onze aanpak was geïnspireerd door een eerdere poging waarbij de novo-eiwitten werden ontworpen die slangengif-neurotoxinen neutraliseerden en muizen beschermden. Voor zover wij weten zijn er nog geen de novo-ontworpen binders tegen schorpioen-neurotoxinen beschreven.

Voor deze campagne kozen we ervoor om ons te richten op vijf neurotoxinen uit schorpioengif uit vier regio's:

• Mexico (Cn2)
• Brazilië (Ts1)
• Noord-Afrika (AaH I en AaH II)
• Het Midden-Oosten (LqhIII)

We kozen er ook voor om de ontwerpen te richten op de kanaal-bindingsplaats van elk toxine. Claude selecteerde de toxine-structuren voor het ontwerp door te zoeken in de Protein Data Bank (PDB) en de AlphaFold-database (AFDB). Voor elk toxine selecteerde het vijf 'hotspots': specifieke aminozuurposities op het toxine waaraan de binder-ontwerpen zich moesten hechten.

We vroegen ons primair af of Claude binders kon ontwerpen tegen individuele toxinen, maar we waren ook benieuwd of Claude binders kon ontwerpen die meerdere toxinen targetten. Er is een praktische reden voor het ontwerpen van multitoxine-binders: het zou het aantal moleculen verminderen dat nodig is voor een universele cocktail van tegendiggif, wat de meest kosteneffectieve en regionaal neutrale behandeling zou zijn. We selecteerden deze vijf schorpioentoxinen (Cn2, Ts1, AaH I, AaH II en LqhIII) als een uitdagende test voor multitoxine-ontwerp: ze delen één vouwing voor de algemene vorm van het eiwit, maar elke twee zijn slechts 26% tot 62% identiek in hun aminozuursequenties.

Om te zien hoe ver Claude kon gaan, vroegen we het om vier soorten binders te ontwerpen:

1. Binders tegen elk van de vijf toxinen individueel.
2. Binders die zich richten op de $\beta$-familie toxinen Ts1 en Cn2.
3. Binders die zich richten op de $\alpha$-familie toxinen AaH II, AaH I en LqhIII.
4. Binders die zich gelijktijdig op alle vijf de toxinen richten.

"Het parallel ontwerpen van geloofwaardige binders tegen vijf toxinen in slechts enkele dagen is een geweldige demonstratie van de AI-gestuurde paradigmaverschuiving die we zien in de therapeutische ontdekking. Dit geldt in het bijzonder voor verwaarloosde ziekten zoals dierlijke vergiftigingen, die grotendeels zijn verstoken van innovatie vanwege lage commerciële prikkels. Het vermogen om agentisch de uniek brede target-ruimte van dierlijke toxinen aan te pakken, zorgt voor een aanzienlijke versnelling in ontdekking en brengt realistische therapeutische oplossingen veel dichterbij."

Timothy P. Jenkins, Associate Professor, Technische Universiteit Denemarken.

Claude voerde de ontwerpcampagne met aanzienlijke autonomie uit

Onze initiële prompt definieerde de doelen van de neurotoxinen, de tools voor eiwitontwerp en -vouwing, en de regels voor nieuwheid, scoring en filtering. Naast het kiezen van de structuren en aminozuur-hotspots, stelde Claude ook de kwaliteitsdrempels vast waar een ontwerp aan moest voldoen, bepaalde hoeveel er op elk beschikbaar ontwerpinstrument werd geleund en ontwikkelde strategieën voor het ontwerpen van binders tegen meerdere toxinen.

Uiteindelijk gebruikte Claude 12 ontwerptools om 318.484 ontwerpen te genereren, waarbij alle ontwerpen werden weggefilterd die leken op een toxine of een bekend eiwit. Claude voerde co-folding en screening uit op 553.052 ontwerp-toxine-paren, waarbij de structuur van elk paar als één complex werd voorspeld. Zesenvijftig uur nadat we Claude de initiële prompt hadden gegeven, produceerde het de definitieve lijst van 180 ontwerpen. De campagne verbruikte ongeveer 10.000 GPU-uren. [^2]

Claude werkte 24 uur autonoom na onze eerste prompt. De resultaten moedigden ons aan om Claude te vragen de campagne voort te zetten en naar betere ontwerpen te zoeken. Onze vervolgvragen waren voornamelijk gericht op het sturen van Claude om een multitoxine-binder te ontwerpen. Claude selecteerde de meeste van de 180 ontwerpen — inclusief onze sterkste binder (Cn2-B1) — pas na onze derde vervolgvraag. Op ons verzoek stuurde Claude de eiwitsequenties naar Twist Bioscience (in e-mails die door Claude waren geschreven), die de eiwitten produceerde om te zien hoe goed ze aan de toxinen zouden binden. Later werkten we met Claude samen om nog eens 31 ontwerpen toe te voegen, waardoor het totaal op 211 kwam: 60 ontwerpen tegen een enkel toxine (12 per toxine), 30 ontwerpen tegen de twee $\beta$-familie toxinen, 30 ontwerpen tegen de drie $\alpha$-familie toxinen en 91 ontwerpen tegen alle vijf de toxinen.

Van de 211 geteste ontwerpen voldeden er 17 aan onze criteria voor een binder, elk tegen een enkel toxine. Geen van de ontwerpen die tegen meerdere toxinen waren gemaakt, voldeed aan onze criteria voor meer dan één toxine. (Naast de huidige beperkingen van de AI, kunnen er veel verklaringen zijn waarom Claude hiermee worstelde, waaronder onze prompting, de beperkingen van de beschikbare ontwerptools en zelfs de biologische haalbaarheid van multitoxine-ontwerp.) Zeven ontwerpen waren binders tegen Cn2, vier tegen AaH II, vier tegen AaH I en twee tegen LqhIII. Onder de 60 enkel-toxine ontwerpen waren er 11 binders (18%). Dit percentage is consistent met typische eiwitontwerpcampagnes, inclusief ons eerdere werk.

Het testen van de ontwerpen van Claude in het laboratorium

Na voltooiing van de campagne stuurden we de ontwerpen naar Adaptyv Bio en Twist Bioscience om ze op binding te testen. Beide groepen produceerden de ontwerpen in hun laboratoria, maar in verschillende formaten. Adaptyv Bio uitte ze in een celvrij systeem, dat gebruikmaakt van eiwit-producerende machinerie geëxtraheerd uit bacteriën in plaats van levende cellen. Twist Bioscience uitte de ontwerpen in zoogdiercellen (in dit geval menselijke niercellen) als fusies met Fc, de stam van een antilichaam. Dit zijn complementaire manieren om het onderliggende bindingsproces te meten, en we hebben ze gecombineerd om de betrouwbaarheid van onze resultaten te vergroten.

Beide laboratoria maten de binding via surface plasmon resonance (SPR), waarbij een toxine over het ontwerp stroomt terwijl het SPR-instrument in realtime bijhoudt hoe snel een toxine zich bindt en weer loslaat. De resulterende curve, een sensorgram genoemd, levert een meting op die bekendstaat als de dissociatieconstante ($KD$), wat een maat is voor de bindingssterkte (of affiniteit). Hoe lager de $KD$, hoe sterker de binding.

Bij het evalueren van de resulterende ontwerpen stelden we strikte criteria op om een ontwerp als binder tegen een toxine aan te merken:

• Het ontwerp moest in beide laboratoria een 'hit' zijn [^3].
• Er moest bewijs zijn van binding tegen dat toxine in elke replica.
• Elke $K_D$ moest $1 \mu M$ of sterker zijn.
• Het ontwerp mocht geen signaal vertonen tegen CLEC12A, een niet-gerelateerd menselijk eiwit dat wordt gebruikt om off-target binding of "plakkerigheid" te meten.

De Cn2-binders van Claude binden waarschijnlijk op dezelfde plek als een toxine-neutraliserend antilichaam

Antilichamen en nanobodies blijven de standaard waar de novo-ontwerpen tegen moeten concurreren. Drie van deze moleculen hebben gerapporteerde affiniteiten ($K_D$) onder de 1 nM (nanomolair) tegen Cn2 of AaH II, en ze zijn aangetoond effectief in het beschermen van muizen tegen schorpioentoxinen.

Onze twee sterkste binders, die we Cn2-B1 en Cn2-B2 noemen, richten zich op Cn2, een neurotoxine van de Mexicaanse schorpioen Centruroides noxius. Beiden bonden Cn2 stevig in zowel Adaptyv Bio als Twist Bioscience, met affiniteiten ($K_D$) in het enkelvoudige nanomolaire bereik.

Een manier om uit te zoeken of twee moleculen (bijv. een antilichaam en een minieiwit) op dezelfde plek op een doelwit binden, is via een competitie-experiment. Hierbij wordt getest of beide binders zich tegelijkertijd aan het doelwit kunnen hechten. Als de aanwezigheid van het ene molecuul de binding van het andere molecuul vermindert, concurreren ze waarschijnlijk om dezelfde bindingsplaats.

Onze competitie-experimenten suggereren dat onze Cn2-binders zich elk hechten aan of nabij hetzelfde epitoop (bindingsplaats) als een antilichaam genaamd LR, waarvan is gerapporteerd dat het Cn2 in muizen neutraliseert. De bindingsplaats van LR beslaat het deel van Cn2 dat zich aan het natriumkanaal hecht en ervoor zorgt dat zenuwen verkeerd vuren. We hebben onze sterkste binders, Cn2-B1 en Cn2-B2, nog niet getest in een cellulaire omgeving of in levende dieren, maar het feit dat ze concurreren met LR suggereert dat ze Cn2 waarschijnlijk zullen neutraliseren.

Een binder is slechts de eerste stap naar de ontwikkeling van een tegendiggif

Onze resultaten tonen enkel binding aan tegen recombinante toxinen, die in het laboratorium worden gekweekt vanuit het gen van elk toxine in plaats van gezuiverd uit gif. De twee grootste beperkingen van deze studie zijn dat we geen enkel ontwerp hebben getest op neutralisatie in vitro (tegen in het lab gekweekte cellen) of op effectiviteit in vivo (in levende dieren, zoals muizen).

Als we één ontwerp naar een therapie zouden willen brengen, zou Cn2-B1 een van onze sterkste kandidaten zijn. Eerst zouden we echter moeten bevestigen dat het ontwerp ook bindt aan toxine dat uit gif is gezuiverd. Vervolgens zouden we de functie in vitro beoordelen met patch-clamp opnames (die de elektrische stroom door natriumkanalen kunnen meten) om te zien of het voorkomt dat het toxine op het kanaal inwerkt. Daarna zouden we de binder in muizen moeten testen om te zien of deze hen daadwerkelijk beschermt. Naast het neutraliseren van het toxine moet een behandeling ook veilig, stabiel, betaalbaar en beschikbaar zijn op de plekken waar de steken voorkomen. Het bereiken van patiënten zal ook samenwerking vereisen van clinici, financiers en beleidsmakers.

We stellen alle 211 ontwerpen en hun bindingsdata beschikbaar, zodat andere onderzoekers voort kunnen bouwen op ons werk. We hopen dat deze demonstratie van de mogelijkheden van Claude, samen met de data die we vrijgeven, zal helpen het verdere onderzoek naar de ontwikkeling van tegendiggif te versnellen.

Aanvullende lectuur

De volgende bronnen bieden meer technische diepgang en gedetailleerde informatie over de bovenstaande resultaten:

• Technisch rapport.
• Datarelease: alle 211 ontwerpen, hun voorspelde structuren en scores, en experimentele data.
• Onze eerdere berichten over eiwitontwerp en het verbeteren van biomoleculaire modellering.

***

Voetnoten [^1]: Citrini heeft hier een artikel geschreven over onze samenwerking. [^2]: We beseffen dat dit veel meer is dan de meeste onderzoekers tot hun beschikking hebben. Afzonderlijk hebben we deze modellen gemiddeld ongeveer 4x sneller gemaakt en aangetoond dat een vereenvoudigde prompt met één agent en één GPU over 24 uur vergelijkbare in silico scores behaalt. [^3]: LqhIII werd uitsluitend beoordeeld door Adaptyv Bio.